TUULI TIMONEN JA MAURI KORHONEN

Sieniharrastajat saattavat ihmetellä, mihin mikroskooppia käytetään sieniä määritettäessä. Mikroskopoimalla nähdään sienistä lisää tuntomerkkejä, joiden avulla lajimääritystä voidaan varmentaa. Kuivattujen sienikeräysten mikroskopointi kenttäkauden jälkeen talvisaikaan on mielenkiintoista puuhaa ja edistää henkilökohtaista lajituntemusta. Tässä artikkelissa tarkastelemme mikroskooppia ja sen käyttöä sieniharrastajan näkökulmasta.

 

Sienikirjoista ja -artikkeleista näemme, että sienten määritystyössä katsotaan monenlaisia mikroskooppisia tuntomerkkejä. Mikroskooppia tarvitaan selvitettäessä itiöiden kokoa ja muotoa. Muita mikroskooppisia rakenteita ovat basidiot eli itiökannat tai itiökotelot, mallon ja pintakelmun rihmojen solujen koko, muoto ja sisältö. Tärkeitä tuntomerkkejä ovat myös pintakelmun, heittojen ja jalan kystidit, jotka ovat itiöemästä esiinpistäviä soluja. Eri mikroskooppisten tuntomerkkien merkittävyydessä on eroja sieniryhmien välillä. Myös tuntomerkkien mittaaminen on oleellinen osa havaintojen tekoa. Mikroskooppiin liitettävien lisälaitteiden avulla voidaan tehdä muistiinpanoja piirtämällä ja valokuvaamalla. Sienten määrityksessä mikroskooppi on erinomainen työväline ja oikein pidettynä pitkäikäinen. Niille jotka aloittelevat sienten mikroskopointia suosittelemme ruotsinkielistä julkaisua Svampstudier med mikroskop (Strid 1983), joka on erinomainen käsikirja mikroskoopin käytöstä ja sienten tunnistamissa käytetyistä mikroskooppisista tuntomerkeistä.

 

Mikroskooppi

mikroskoppi

Kuva 1. Kaavakuva läpivalaisumikroskoopista ja valon kulusta mikroskoopissa

Läpivalomikroskooppi on optinen laite, jonka avulla kohdetta voidaan tarkastella jopa 1500-kertaisella suurennuksella. Edellytyksenä on, että mikroskoopin säädöt ovat oikein asetetut. Suurennettu kuva muodostuu optisesta kokonaisuudesta, joka alkaa mikroskoopin valonlähteestä ja jatkuu kondensorin, preparaatin, objektiivin ja okulaarien kautta katsojan silmiin asti (kuva 1).

Tarjolla on niin runsas valikoima mikroskooppeja, että siitä saattaa syntyä valinnan vaikeutta. Siksi ennen hankintaa on hyödyllistä kysellä muiden sieniharrastajien ja -tutkijoiden mielipiteitä mikroskoopeista. Tutkimusmikroskoopit ovat kalliita, mutta sieniharrastaja selviää mainiosti tavallisella (vaaleakenttä) mikroskoopilla, esimerkiksi hyvällä kurssimikroskoopilla. Käytettyjä hyvälaatuisia ja hyväkuntoisia mikroskooppeja voi nykyisin saada hyvinkin edullisesti. Tällöin on kuitenkin huomioitava, että kondensori, objektiivit ja okulaarit ovat keskenään yhteensopivia.

Useimmille harrastelijoille riittää hyvin kolme erilaista objektiivia, esim. 10 x ja 40 x suurentavat kuivaobjektiivit sekä 100 x suurentava öljyimmersio-objektiivi. Mittaamista varten tarvitaan mittaokulaari tai okulaariin laitettava okulaarimikrometri sekä mitta­ okulaarin kalibrointiin objektimikrometri. Sitä ei välttämättä tarvitse ostaa vaan sen voi lainata kalibrointia varten. Jos haluaa tehdä muistiinpanoja piirtämällä, mikroskoopin on oltava sellainen, että siihen voidaan liittää piirustustubus. Valokuvaamista varten tarvitaan mikroskooppiin sopiva valokuvaustubus, sovite ja kamera.

 

Mikroskoopin käyttäminen

Mikroskoopin säädöt on tehtävä huolellisesti ohjeiden mukaan, jotta tutkittava kohde näkyisi mahdollisimman hyvin. Ensiksi säädetään mikroskoopin okulaarit katsojan silmille sopiviksi ja sitten valon kulku käytettävälle objektiiville ja mikroskopoitavalle preparaatille optimaaliseksi eli tehdään ns. Köhlerin valaistus. Näin menetellen saavutetaan paras mahdollinen mikroskopointitulos.

Okulaarisäätöjä tehdessä käytetään kuiva­ objektiivia. Ensiksi säädetään mikroskoopin okulaarit käyttäjän silmäväliä vastaavaksi muuttamalla okulaarien välistä etäisyyttä. Seuraavaksi säädetään molemmat okulaarit erikseen käyttäjän silmien polttoväliä vastaavaksi. Tämä tehdään siten, että preparaattia katsotaan toisella silmällä säädettävänä olevan okulaarin kautta ja tarkennetaan kohde teräväksi tarkennusmekanismista. Sitten katsotaan toisella silmällä toiseen okulaariin ja säädetään kohde teräväksi okulaarin omasta säädöstä. Näin mikroskopoijan molempien silmien mahdollinen näkövirhe saadaan korjattua, jolloin silmät eivät rasitu mikroskopoitaessa. Silloin kun toisessa okulaarissa on mitta, niin se säädetään teräväksi okulaarin omasta säädöstä. Sen jälkeen tässä okulaarissa näkyvä näyte tarkennetaan teräväksi tarkennusmekanismista. Toisessa okulaarissa näkyvä näyte tarkennetaan teräväksi okulaarin omasta säädöstä. Jos näihin säätöihin ei tämän jälkeen enää kajota, ne pysyvät oikeina eikä säätöjä tarvitse tehdä joka kerta uudelleen.

Varsinainen mikroskopointi aloitetaan vähiten suurentavalla objektiivilla, jolla helpoimmin löytää tutkittavan kohdan preparaatista. Kun käytetään 10 x suurentavaa objektiivia, tarkentaminen tehdään karkeasäädöllä, mutta siirryttäessä suurempiin suurennuksiin käytetään vain hienotarkennusta. Tällöin ei ole vaaraa, että tarkennettaessa objektiivin etulinssi osuisi peitinlasiin ja rikkoisi sen.

Öljyimmersio-objektiivilla työskenneltäessä tarvitaan immersioöljyä. Ennen öljyimmersio-objektiivin käyttöä tutkittava kohta etsitään preparaatista kuivaobjektiivilla. Sitten kuivaobjektiivi käännetään sivuun ja pieni pisara immersioöljyä pannaan peitinlasin päälle kohteen kohdalle ja öljyimmersio-objektiivi käännetään paikalleen. Työskentely öljyimmersio-objektiivin kanssa vaatii erityistä huolellisuutta, ja on varottava, etteivät kuivaobjektiivit missään tapauksessa työskentelyn aikana tahriinnu öljyyn.

Mitä enemmän objektiivi suurentaa sitä enemmän tarvitaan valoa. Siksi mikroskopoitaessa joudutaan aina säätämään valon määrää käytettävän objektiivin ja preparaatin mukaan. Mikroskopoijan on syytä välttää liian voimakkaan valoa, sillä se häikäisee silmiä ja huonontaa näkemistä.

kenttahimmennin

Kuva 2. Kenttähimmentimen korkeuden säätö ja valon kulun keskiöinti

Mahdollisimman hyvän erotuskyvyn saavuttamiseksi mikroskooppiin on säädettävä Köhlerin valaistus eli tehdään jokaista objektiivia ja mikroskopoitavaa preparaattia varten erikseen keskitetty valon kulun optimaalinen säätö (kuva 2). Se tehdään siis aina erikseen kullekin preparaatille ja objektiiville.

Köhlerin valaistuksen säätö:

  1. Avaa kenttä- ja apertuurihimmentimet
  2. Tarkenna kohde teräväksi mikroskoopin tarkennusmekanismista.
  3. Himmennä kenttähimmennintä noin 1/3 täydestä aukosta, jolloin himmentimen lehdet peittävät osan näkökentästä (kuva 2a).
  4. Tarkenna kenttähimmentimen lehtien reunat teräviksi kondensorin korkeuden säätönupilla (kuva 2b).
  5. Jos himmentimen lehtien rajaama valoisa alue ei ole näkökentän keskellä, keskiöi se kondensorin keskiöintiruuveilla (kuva 2c ja d).
  6. Avaa kenttähimmentimen aukkoa sen verran, että himmentimen lehdet siirtyvät juuri ja juuri näkökentän ulkopuolelle, jolloin koko näkökenttä näkyy valoisana (kuva 2e ja f).
  7. Lopuksi himmennä apertuurihimmentä (kondensorihimmennintä) vähän. Muista, että himmentäminen lisää hieman terävyysaluetta, mutta huonontaa erotuskykyä.

Köhlerin valaistuksella säädetään siis kondensorista tuleva valokiila käytettävän objektiivin etulinssin kokoiseksi ja rajataan pois ylimääräinen sivulle menevä hajavalo. Näin saadaan käyttöön objektiivin koko valovoima ja kuvan muodostavan valon laatu mahdollisimman hyväksi. Köhlerin valaistuksen teko saattaa aluksi tuntua työläältä, mutta kun sen oppii, köhleröinti sujuu kuin itsestään.

Yleisiä virheitä mikroskopoinnissa:

  1. Mikroskoopin säädöt virheelliset, jolloin kuvan laatu on huono.
  2. Valo liian voimakas, mikä häikäisee silmiä ja huonontaa näkemistä.
  3. Liiallinen apertuurihimmentimen himmentäminen, josta seuraa huonontunut erotuskyky.
  4. Värireagenssi tahrinut objektiivin etulinssin, jolloin kuva näkyy suttuisena.
  5. Immersioöljyä joutunut kuivaobjektiivin etulinssiin, mikä voi vaurioittaa linssiä.
  6. Mikroskoopin valo unohdetaan sammuttaa työskentelyn jälkeen.
  7. Mikroskooppia ei käytön jälkeen peitetä pölyltä suojaavalla hupulla.

 

Mikroskoopin hoito ja huolto

Mikroskoopin pahin vihollinen on pöly. Jo pienikin pölymäärä on haitallista ja siksi mikroskooppia on suojeltava pölyltä. Kun mikroskooppia ei käytetä, se on peitettävä suojahupulla. Mikroskoopin sisäosat pysyvät pölyttöminä, kun okulaarit ja objektiivit ovat aina paikoillaan ja kaikissa tyhjissä aukoissa on suojatulpat. Mikroskoopin linssipintojen (objektiivien, okulaarien j a kondensorin) puhdistamiseen saa käyttää vain linssipaperia. Ennen linssipaperin käyttöä linssipintoja naarmuttavat hiekanjyväset ja muut suuremmat roskat poistetaan varovasti puhtaalla siveltimellä tai puhalletaan pois. Puhdistettaessa on varottava koskemasta linssipintoihin paljain sormin. Jotta mikroskooppi pysyisi mahdollisimman puhtaana, näytteitä ei pidä käsitellä eikä preparaatteja valmistaa mikroskoopin välittömässä läheisyydessä.

Oljyimmersio-objektiivi on puhdistettava öljystä työskentelyn jälkeen päivittäin. Enin öljy pyyhitään pois pumpulitupolla tai linssipaperilla. Sen jälkeen loput öljyt poistetaan puhdistusnesteeseen (50 ml tislattua vettä, 50 ml 2-propanolia, 1 ml 25 % ammoniakkia) kostutetulla linssipaperilla. Lopuksi linssipinta kuivataan puhtaalla linssipaperilla. Jos kuivaobjektiivien linsseihin on joutunut öljyä, objektiivit on puhdistettava välittömästi puhdistusnesteellä edellä kerrotulla tavalla. Kuivaobjektiivien turhaa pyyhkimistä puhdistusnesteellä on kuitenkin syytä välttää, koska objektiivin reunassa oleva mahdollinen lika leviää helposti linssipinnalle. Puhdistusneste sopii myös muiden mikroskoopin pintojen, kuten ristipöydän, puhdistamiseen.

Oikein käytettynä ja puhtaana pidettynä mikroskooppi on hyvin pitkäikäinen työväline, joka tarvitsee vain joskus ammattilaisen suorittamaa perusteellista puhdistusta ja huoltoa. Jos mikroskooppi on pitkään käyttämättä, sen säädöt saattavat jäykistyä. Säätönuppeja liikuttelemalla tilanne yleensä korjautuu, mutta jos se ei auta, on aika huollattaa laite. Silloin kun mikroskooppia joudutaan kuljettamaan, se on pakattava hyvin, ettei mikroskooppi kolhiudu ja joudu tärinälle alttiiksi.

 

Preparaatin valmistaminen

Mikroskopoitavia näytteitä voidaan tehdä sekä tuoreista että kuivatuista sienistä. On muistettava, että keskenkasvuisissa itiöemissä kaikki rakenteet eivät ole täysin kehittyneitä. Sienipreparaattien valmistaminen onnistuu vähin välinein; tarvitaan vain alus- ja peitinlaseja, puhdasta vettä, pipetti, atulat ja partakoneen teriä. Mikroskopoitavaksi sopivat parhaiten ohuet tasapaksut näytteet, joita harrastelijakin oppii tekemään pienen harjoittelun jälkeen. Tarvittaessa voidaan käyttää myös värireagensseja, joilla saadaan näkyviin lisää haluttuja yksityiskohtia.

Mikroskopoitava preparaatti tehdään laittamalla ohut näytepala tai partakoneen terällä käsivaraisesti tehty leike aluslasilla olevaan vesi- tai väriliuospisaraan (esim. Melzerin liuos, puuvillasini eli Cotton Blue, 5 % kaliumhydroksidiliuos, katso tarkemmin Suursieniopas 1976 ja Niemelä 2005) ja päälle asetetaan varovasti peitinlasi. Lyijykynän peräpäällä kevyesti naputtaen, kuitenkin niin ettei peitin­ lasin pinta kastu, näyte saadaan painumaan tiiviimmin lasien väliin, mikä mikroskopoitaessa parantaa yksityiskohtien erottumista. Kohde on nyt valmis mikroskopoitavaksi. Jotta havainnot olisivat mahdollisimman luotettavia, samasta näytteestä täytyy yleensä tehdä ja mikroskopoida useita preparaatteja.

Jos näyte mikroskopoinnin aikana alkaa kuivua, pitää nestettä lisätä. Se onnistuu laittamalla pieni nestepisara peitinlasin reunaan, josta se imeytyy kapillaarisesti peitinlasin alle. Peitinlasin reunaan laitettuun imupaperiin imeytetään liika neste preparaatista. Aluslaseja voidaan käyttää useaan kertaan. Aluslasit puhdistetaan pesemällä ne astianpesuliuoksessa ja huuhtomalla puhtaassa vedessä.

 

Kohteiden mittaaminen

Määritysten varmistamisessa mikroskooppisten kohteiden mittaaminen on usein välttämätöntä. Mittaus tehdään joko okulaarimikrometrin avulla suoraan kohteesta tai piirustustubuksella piirretystä kuvasta, jonka mittakaava tiedetään.

Jotta mittaus voidaan tehdä okulaarimikrometrissä oleva mitta-asteikko, on kalibroitava objektimikrometrin avulla. Kalibrointi tehdään kullekin käytettävälle objektiiville erikseen..

Okulaarimikrometrin kalibrointi:

  1. Laita ristipöydälle preparaatin tilalle objektimikrometri ja valitse mittauksessa käyttämäsi objektiivi, tarkenna asteikko teräväksi ja tee Köhlerin valaistus.
  2. Käännä okulaarimikrometrin asteikko objektimikrometrin asteikon suuntaiseksi ja siirrä ristipöydän säädöillä asteikkojen aloituskohdat kohdakkain.
  3. Hae kohta, jossa asteikot ovat seuraavan kerran kohdakkain ja laske molempien asteikkovälien lukumäärät. Objektimikrometriin on merkitty jakovälin pituus, jonka avulla voi laskea okulaarimikrometrin asteikko­ välin pituuden (kuva 3).

Mittauksien nopeuttamiseksi kannattaa jakovälien pituuksista tehdä kullekin objektiiville omat taulukkonsa, joista näkee mitat suoraan ilman laskutoimituksia (taulukko 1). Mittoja ilmoittaessasi katso tarkasti, että luvut ovat käyttämällesi objektiiville tehdystä taulukosta.

 

Taulukko 1. Esimerkki peruslaboratoriomikroskoopin okulaarimikrometrin yhden jakovälin pituudesta eri objektiiveilla käytettäessä 10 x okulaareja.

Objektiivi  Jakovälin pituus mm  mikrometreinä
4x 0,024 mm 24 µm
5x 0,020 mm 20 µm
10x 0,01 mm 10 µm
20x 0,005 mm 5 µm
40x 0,0025 mm 2,5 µm
50x 0,002 mm 2 µm
63x 0,00159 mm 1,59 µm
100x 0,001 mm 1 µm

 

 

Kohteiden dokumentointi piirtämällä ja valokuvaamalla

Mikroskooppiin liitettyjen lisälaitteiden avulla mikroskoopilla voidaan dokumentoida piirtämällä ja valokuvaamalla. Piirtämiseen tarvitaan piirustustubus, joka asetetaan mikroskooppiin objektiivirevolverin ja okulaaritubuksen väliin. Tarjolla on kahdenlaisia piirustustubuksia; sellaisia joiden mittakaavaa säädetään portaattomasti ja sellaisia jotka säätyvät vain portaittain. Valokuvaamiseen tarvitaan valokuvaustubukseen liitetty filmi- tai digitaalinen kamera.

Piirustustubuksen avulla piirrettäessä mikroskoopissa näkyvä kuva heijastetaan tubuksen kautta mikroskoopin vieressä työpöydällä olevalle paperille, johon kohde piirretään. Jotta heijastettu kuva ja mikroskopoijan kynä näkyisivät samanaikaisesti, paperille on heijastettava valoa pöytälampulla. Säätämällä mikroskooppikuvan valoisuuden ja lampun heijastaman valon määrän suhdetta saadaan heijastuva kuva ja kynän kärki näkyviin riittävän hyvin. Vanhojen mikroskooppien valo on usein liian heikko, mutta piirtäminen onnistuu, jos huoneen valoisuutta vähennetään ja paperia valaistaan pöytälampulla sopivalta etäisyydeltä.

Kuva 3. Okulaarimikrometrin (mitta-asteikko vasemmalla) kalibrointi objektimikrometrin avulla (mitta-asteikko oikealla). Kuvassa okulaarimikrometrin 100 väliä vastaa objektimikrometrin 122 väliä eli okulaarimikrometrin mitan yksi numeroväli on 12,2 µm kyseisellä suurennuksella. – Kuva Strid 1983.

Kuva 3. Okulaarimikrometrin (mitta-asteikko vasemmalla) kalibrointi objektimikrometrin avulla (mitta-asteikko oikealla). Kuvassa okulaarimikrometrin 100 väliä vastaa objektimikrometrin 122 väliä eli okulaarimikrometrin mitan yksi numeroväli on 12,2 µm kyseisellä suurennuksella. – Kuva Strid 1983.

Mikroskooppipiirrokset on hyvä piirtää samaan mittakaavaan, jolloin niitä on helppo vertailla keskenään. Portaittain säätyvissä tubuksissa mittakaava pysyy muuttumattomana, kunhan muistetaan valita aina sama porras. Portaattomasti säätyvissä tubuksissa mittakaava saattaa huomaamatta muuttua. Siksi on hyvä varmuuden vuoksi teipata tubus niin, ettei mittakaava vahingossa pääse muuttumaan. Työskenteltäessä öljyimmersio-objektiivilla piirroksen mittakaavaksi kannattaa valita 2000-kertainen suurennus. Tällöin insinöörimittatikun mittakaavalla 1/50 voidaan piirroksesta mitata mikrometrit suoraan 1/4 µm tarkkuudella.

Piirroksilla ei ole paljonkaan arvoa, jos niistä puuttuu näyte- ja mittakaavatiedot. Piirrokseen tehdään objektimikrometrin avulla mittakaavajana, jota käyttäen voidaan mitata piirrettyjä kohteita. Piirroksien mittajanoja vertaamalla voidaan myös varmistaa, etteivät mittakaavat ole missään vaiheessa muuttuneet. Okulaarimikrometrillä tehtyihin mittauksiin verrattuna piirroksista mittaaminen on helpompaa, ja mittaukset voidaan tarvittaessa tarkistaa uudelleen. Mielestämme piirtäminen on suositeltava tapa tehdä mikroskooppisia muistiinpanoja. Piirroksista näkyy myös hyvin tutkittavien kohteiden koko, muoto ja yksityiskohdat (M. Korhonen 2011). Kun dokumentoidaan piirtämällä, voidaan valita vapaasti piirrettävät kohteet ja muuttaa tarkennustasoa niin, että piirrokseen saadaan näkyville muotojen ja kokojen lisäksi haluttuja yksityiskohtia. Piirtämisen etuna on sekin että kuvan voi sommitella halutunlaiseksi.

Toisin kuin piirrettäessä valokuvattaessa kuvan sommitteluun voi vaikuttaa vain vähän. Hyvän rajauksen löytäminen on suuritöistä, koska kuvauksellisten kohteiden lisäksi rajatulle alueelle usein osuu asiaan kuulumattomia seikkoja kuten ilmakuplia ja roskia. Mikrovalokuvauksen toinen ongelma on terävyysalueen vähäisyys. Ainoastaan tarkennustasossa olevat kohdat näkyvät kuvassa terävinä ja kaikki muu on enemmän tai vähemmän epäterävää. Jos kohde on vähänkään kolmiulotteinen, niin sen epäterävyys korostuu häiritsevänä. Siksi valokuvaamiseen valitun preparaatin pitää olla korkealaatuisempi kuin piirtämiseen tarvittavan preparaatin.

Filmille valokuvatessa on muistettava säätää mikroskoopin valonlämpötila keinovalo­ tai päivänvalovärifilmille sopivaksi. Oikean valotuksen löytämiseksi on syytä haarukoida valotus mittarin mukaan ja siitä puoli aukkoa yli ja puoli aukkoa ali. Digitaalisen kameran etuna on, että kuvan laadun näkee heti, jolloin tarvittaessa kuvauksen voi uusia saman tien. Piirtämiseen verrattuna valokuvaamalla dokumentointi vaatii sekä laadukkaampia ja kalliimpia laitteita että korkeatasoisempia preparaatteja ja kuvaajalta hyvää ammattitaitoa.

 

 

Korhonen, M. 2011: Punikkitatti: yksi vai viisi lajia. Sienilehti 63: 35-43.

Niemelä, T. 2005: Käävät, puiden sienet, (lyhenteitä s. 24). Kasvimuseo, Luonnontieteellinen keskusmuseo, Helsinki. 319 s. ISBN 952-10-2744-4

Strid, Åke 1983: Svampstudier med mikroskop.  Sveriges Mykologiska Förening. 82 s. ISBN 91-86586-00-9

Ulvinen, T. (toim.) 1976: Suursieniopas, (Sienten määrittämisessä käytettäviä kemikaaleja s. 32). Suomen Sieniseura ry. Helsinki. 360 s. ISBN 951-95362-0-5

 

Tuuli Timonen

s-posti: tuuli.timonen[ÄT]helsinki.fi

 

Mauri Korhonen

s-posti: mauri.korhonen[ÄT]helsinki.fi

 

Julkaistu Sienilehdessä 3/2011
ks. myös http://www.funga.fi/Sienilehti/SL2011-3.pdf#page=5&view=Fit